Badania chemiczne i toksykologiczne

Metodyka badań chemicznych bentosu

Zawartość tłuszczu oraz kwasów tłuszczowych oznaczone będą w gatunku (Mytilus sp.), który powszechnie jest stosowany w programach monitoringowych jako organizm wskaźnikowy do oceny jakościowej stanu środowiska. Ponadto, małże są istotnym komponentem diety kilku występujących w Zatoce gatunków ryb.

Oznaczenia chemiczne wykonane zostaną na 6 stacjach badawczych, na których w ramach badań makrozoobentosu potwierdzone zostanie występowanie ławic omułka z uwzględnieniem lokalizację punktowych źródeł zanieczyszczeń (miejsca zrzutu zasolonych wód i ścieków w rejonie Mechelinek). Badania wykonane zostaną w próbkach zintegrowanych, złożonych z minimum 100 osobników. Po złowieniu małże będą przywiezione do laboratorium i głodzone przez 24-48 godzin, tak aby wykonane oznaczenia odnosiły się do przyswojonych składników pokarmowych z wykluczeniem zawartości przewodu pokarmowego. Próbki będą mrożone do czasu wykonania analiz chemicznych.

Oznaczenia zwartości tłuszczu wykonane zostaną w tkance miękkiej poddanej liofilizacji. Zawartość tłuszczu w badanych próbkach małży określana będzie grawimetrycznie na drodze ekstrakcji metodą Folcha (metoda standardowo używana w badaniach biochemicznych do oznaczenia zawartości lipidów), za pomocą mieszaniny dichlorometan-metanol.

Kwasy tłuszczowe oznaczone zostaną w lipidach wyekstrahowanych z próbek (pkt. 2.2.1) z zastosowaniem chromatografii gazowej, zgodnie z metodyką opracowaną i zwalidowaną w MIR-PIB. Analiza chromatograficzna kwasów tłuszczowych zostanie wykonana po uprzednim przeprowadzeniu ich w odpowiednie estry metylowe. Oznaczenia zawartości kwasów tłuszczowych zostaną wykonywane przy użyciu chromatografu gazowego sprzężonego z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (FID), przy użyciu kolumny kapilarnej RT-2560 (100 m; 0,25 mm; 0,2 μm; Restek). Stężenia poszczególnych kwasów tłuszczowych oznaczone zostaną zarówno jako stężenia procentowe, jak i jako wartości bezwzględne, czyli w mg/g suchej masy.

Metodyka badań chemicznych i zanieczyszczeń w rybach

Badania chemiczne w rybach zgodnie z wymogami Zamawiającego obejmą pomiar zawartości tłuszczu, kwasów tłuszczowych, mikro i makroelementów oraz zanieczyszczeń chemicznych, których poziomy są limitowane w rybach.

Ryby do badań chemicznych zostaną pobrane z dwóch stacji badawczych (po jednej na Zatoce Puckiej wewnętrznej i zewnętrznej). Z każdej stacji do badań pobranych zostanie po 15 osobników każdej płci. Próbę do badań będzie stanowił jeden osobnik. Wybór gatunków ryb do badań uwarunkowany jest ich dostępnością w Zatoce, będzie to stornia i okoń. W rybach tych zostaną wykonane oznaczenia zawartości tłuszczu, kwasów tłuszczowych, jak i makro- i mikroelementów. Złowione ryby będą poddane szczegółowej analizie ichtiologicznej (pomiar długości całkowitej, mokrej masy, mokrej masy bez wnętrzności, określenie płci, stadium rozwoju gonad, stopnia wypełnienia żołądka, pobranie otolitu i określenie wieku). Na podstawie wyników ww. analizy zostaną wybrane osobniki do badań chemicznych. Z każdej badanej ryby, zostanie wycięty przewód pokarmowy i zamrożony w -20°C do czasu wykonania analiz składu pokarmowego. Do badań chemicznych zostanie pobrana tkanka mięśniowa i wątroby ryb, które zostaną zamrożone w temperaturze -70°C.

Zawartość tłuszczu w badanych tkankach ryb określana będzie grawimetrycznie na drodze ekstrakcji metodą Folcha, za pomocą mieszaniny dichlorometan : metanol.

Analizy kwasów tłuszczowych zostaną wykonane w wątrobach ryb. Kwasy tłuszczowe z wątrób będą ekstrahowane metodą Folcha, za pomocą mieszaniny dichlorometan-metanol. Analiza kwasów tłuszczowych zostanie wykonana po uprzednim przeprowadzeniu ich w odpowiednie estry metylowe. Oznaczenia zawartości kwasów tłuszczowych zostaną wykonywane metodą chromatograficzną, na chromatografie gazowym połączonym z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (FID), przy użyciu kolumny kapilarnej RT-2560 (100 m; 0,25 mm; 0,2 μm; Restek). Stężenia poszczególnych kwasów tłuszczowych oznaczone zostaną zarówno jako stężenia procentowe, jak i jako wartości bezwzględne, czyli w mg/g.

W mięśniach ryb zostanie zbadana zawartość mikro- (Fe, Zn, Cu, Sr, Mn, Cr, Se, B) oraz makroelementów (Ca, P, Na, K, Mg). Stosowane będą metodyki opracowane i zwalidowane w MIR-PIB. Mineralizacja zhomogenizowanych próbek przy udziale stężonego kwasu azotowego (65%) i wody utlenionej (30%) prowadzona będzie w piecach mikrofalowych MARS-5 i MSD-2100. W przypadku Se, po mineralizacji, próby dodatkowo ogrzewane będą przez 3 godziny w temperaturze 70°C, a następnie zostanie do nich dodawany kwas solny (25%).

Stężenia Fe, Zn, Cu, Sr, Mn, Cr, B, Ca, P, Na, K, Mg mierzone będą metodą optycznej spektrometrii emisyjnej w spektrometrze ICP-OES (Varian ICP-OES Vista MPX). Pomiar stężenia Se wykonywany będzie techniką generacji wodorków przy użyciu spektrometru absorpcji atomowej połączonego z FIAS 200. Roztwór redukujący to 0,2% borowodorek sodu.

W przypadku zanieczyszczeń chemicznych (dioksyny, polichlorowane bifenyle oraz metale toksyczne -ołów, rtęć, kadm i arsen), oznaczenia będą wykonywane w próbach kompozytowych, składających się z kilku osobników danego gatunku o zbliżonej wielkości. Próby ryb do oznaczenia zanieczyszczeń będą pobrane raz w ciągu roku na 4 stacjach badawczych (Z. Pucka wewnętrzna i zewnętrzna). Stosowane będą metodyki opracowane i zwalidowane w MIR-PIB. Badania zanieczyszczeń organicznych polegać będą na ekstrakcji lipidów z tkanki mięśniowej ryb z użyciem metody ekstrakcji pod zwiększonym ciśnieniem (ASE). Pierwszym etapem będzie pozyskanie tkanki mięśniowej, homogenizacja próby i liofilizacja. Celem zapewnienia reprezentatywności próby, badania wykonane zostaną w próbach kompozytowych, przygotowanych z tkanki mięśniowej kilku, do kilkunastu osobników o zbliżonej długości. Oznaczenia wykonane zostaną przy zastosowaniu chromatografii gazowej z zastosowaniem detektorów ECD i HRMS.

Analizy metali toksycznych w mięśniach ryb obejmować będą Cd, Pb, Hg i As. Mineralizacja próbek do oznaczania Cd, Pb i As wykonywana będzie w identyczny sposób jak w przypadku badań makro- i mikroelementów (6.6.3). Stężenia Cd, Pb i Hg mierzone będą metodą absorpcji atomowej. Stężenia Cd i Pb będą analizowane za pomocą spektrometru absorpcji atomowej Perkin-Elmer 4100 z lampą deuterową do korekcji tła wyposażonym w piec grafitowy HGA-700. Zawartość Hg oznaczana będzie metodą absorpcji atomowej, techniką zimnych par w analizatorze rtęci AMA 254. Stężenia As mierzone będą metodą optycznej spektrometrii emisyjnej w spektrometrze ICP-OES (Varian ICP-OES Vista MPX). Każda seria pomiarowa poprzedzana będzie analizą materiałów odniesienia.

Uzyskane wyniki odniesione zostaną do obowiązujących przepisów związanych z bezpieczeństwem żywności.

Metodyka badań toksyczności osadów z użyciem biotestów

Osady powierzchniowe pobrane zostaną z 5 stacji badawczych jako podpróby z czerpacza dna van Veen. Dla każdej ze stacji zostanie wykonana podstawowa analiza granulometryczna osadów, w ramach której zostaną oznaczone następujące parametry: średnie uziarnienie (i oparta na nim klasyfikacja osadów wg skali Wentwortha), współczynnik wysortowania, zawartość frakcji mulisto – ilastej oraz zawartość materii organicznej.

Do badania toksyczności osadów zostanie wykorzystany biotest „bezpośredniego kontaktu” z osadem, o nazwie handlowej „Ostracodtoxkit F” (Microbiotests Inc., Belgia). Jest to test toksyczności chronicznej. Przeprowadzany jest na płytce wielodołkowej przy użyciu młodych dennych skorupiaków Heterocypris incongruens (małżoraczków), które po inkubacji przez 52 godziny w temperaturze 25°C wylęgają się z cyst. Po pomiarze ich długości, wyselekcjonowane organizmy zostaną przeniesione na badany osad. Po 6 dniach przebywania w osadzie, żyjące organizmy zostaną odzyskane z próbek i określana będzie ich procentowa śmiertelność i wzrost, w odniesieniu do rezultatów uzyskanych w kontakcie z nietoksycznym osadem kontrolnym. Zgodnie z wymogiem testu, każda próbka analizowana będzie w 6-ciu powtórzeniach. W celu sprawdzenia prawidłowości wykonania procedury testowej zostanie wykonany test referencyjny z siarczanem miedzi.

Metodyka badań toksyczności zrzutu oczyszczonych ścieków i zasolonych wód odprowadzonych do Zatoki Puckiej

Do badań toksyczności zostaną użyte komercyjnie dostępne biotesty dedykowane do badań oddziaływania zanieczyszczonych wód morskich oraz estuariowych, ścieków i innych mieszanin, oparte o organizmy modelowe. Testy są opracowane przez producentów zgodnie z odpowiednimi normami. Zapewniają powtarzalność i wiarygodność uzyskiwanych wyników oraz odpowiednią kontrolę jakości. Badania takie są wykorzystywane przy ocenie skuteczności stosowanych procedur oczyszczania ścieków przed ich zrzuceniem. Zgodnie z wymogiem Zamawiającego testy obejmą organizmy z trzech poziomów troficznych: destruenci (bakterie ‐ Vibrio fisheri), producenci (algi ‐ Phaeodactylum tricomutum) i konsumenci (wrotki Brachinious plicatis). Badaniom poddane zostaną oczyszczone ścieki pobrane z oczyszczalni Dębogórze oraz zasolone wody powstające w wyniki płukania złóż soli, odprowadzane do Zatoki Puckiej. Ponieważ zarówno skład oczyszczonych ścieków jak i wód powstających po płukaniu złóż soli może być zmienny w czasie, próbki do badań pobrane będą czterokrotnie w ciągu roku.

Próbki będą badane za pomocą testów o nazwach: Microtox, Marine Algaltoxkit i Rotoxkit M, zgodnie z instrukcjami producenta. Microtox jest światowym standardem w zakresie dokładnego monitoringu toksyczności. Test ten wykorzystuje bakterie luminescencyjne Vibrio fischeri, u których wystawienie na działanie substancji toksycznych powoduje zakłócenie procesu metabolizmu wywołując spadek wytwarzanego światła. Pomiar wartości spadku światła w odniesieniu do próbki kontrolnej jest miarą oceny toksyczności ostrej. Marine Algaltoxkit to mikrobiotest toksyczności chronicznej określanej na podstawie hamowania wzrostu okrzemek Phaeodactylum tricomutum. Natomaist Rotoxkit M służy do pomiaru toksyczności ostrej w wyniku badania śmiertelności wrotek Brachionus plicatilis.